引言：我們?cè)谶M(jìn)行注射劑一致性評(píng)價(jià)研究中，往往會(huì)發(fā)現(xiàn)參比制劑采用了濕熱滅菌工藝，但該濕熱工藝條件有顯然又達(dá)不到F0>8。特別是一些來(lái)源于日本的注射劑，甚至于大輸液的產(chǎn)品，都采用的是F0<8的滅菌工藝，這是怎么回事呢？查閱日本厚生省發(fā)布的《通過(guò)最終滅菌方法生產(chǎn)無(wú)菌藥物的準(zhǔn)則》（下文簡(jiǎn)稱日本的無(wú)菌指南），探究一下日本對(duì)于滅菌工藝選擇的要求。

雖然沒(méi)有像歐盟一樣畫出滅菌選擇決策樹，但是日本在對(duì)滅菌工藝選擇上的邏輯仍是基本一致的。那就是首選121℃，15min的濕熱滅菌條件，次選F0>8的滅菌條件，如果產(chǎn)品不能耐熱，再選擇其他F0<8的其他熱處理工藝。與歐盟無(wú)菌指南不同的是，日本對(duì)于F0<8的濕熱工序選擇有更加詳盡的描述。

在日本無(wú)菌指南的附錄——滅菌條件設(shè)計(jì)法中，提出可以選擇A/B/C/D四種方法中的任何一種，保證產(chǎn)品的無(wú)菌。

A、半周期法；B、過(guò)度殺滅法；C、生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法；D、絕對(duì)微生物負(fù)載法。

A：半周期法

不知道為什么叫這個(gè)名字，從做法來(lái)看似乎應(yīng)該叫雙周期法更合適。這種方法是在滅菌柜冷點(diǎn)的位置放置了初始細(xì)菌計(jì)數(shù)為10⁶?CFU的生物指示劑，其滅菌時(shí)間是所有生物指示劑死亡時(shí)間的兩倍。在過(guò)度殺滅法中，滅菌時(shí)間為12min，而在半周期法中，滅菌時(shí)間為14min至16min。初始細(xì)菌計(jì)數(shù)為10⁶?CFU的生物指示劑的存活概率在7 min時(shí)為10％，在8 min時(shí)為1％，因此（7 min至8min）× 2=14min至16min。與過(guò)度殺滅法相比，半周期法的時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。歐盟藥典推薦的滅菌條件為121℃，15min，其實(shí)按日本的話說(shuō)就是半周期法。歐盟無(wú)菌指南提到采用121℃，15min的滅菌條件的產(chǎn)品申報(bào)時(shí)可以不提交滅菌驗(yàn)證資料，理由應(yīng)該就是半周期法對(duì)無(wú)菌保證有著極高的保險(xiǎn)系數(shù)。

B：過(guò)度殺滅法

就是大家耳熟能詳?shù)腇0>12的滅菌條件，不再贅述。

C：生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法

簡(jiǎn)而言之，這種方法適合于不能終端滅菌，但還是能夠耐受相對(duì)較高的F0值的產(chǎn)品。每批產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)，對(duì)滅菌前產(chǎn)品的耐熱菌種進(jìn)行鑒定，并在滅菌操作時(shí)加入預(yù)設(shè)的生物指示劑。生物指示劑的D值應(yīng)高于每批產(chǎn)品經(jīng)鑒定的耐熱菌的D值。

這種方法基于生物指示劑的D值高于從菌種鑒定試驗(yàn)中獲得的耐熱細(xì)菌的D值的前提，并且滅菌時(shí)間通常根據(jù)以下公式設(shè)置：

滅菌時(shí)間 = D × log No / N

?? D：生物指示劑的D121值

?? No：微生物允許殘存的概率（10^-6）

?? N：細(xì)菌初始數(shù)量

這里的細(xì)菌初始數(shù)量是最大微生物負(fù)載加上標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，即打出1 或2 個(gè)lg值的富余量。過(guò)度殺滅法的F0值能達(dá)到12以上，而生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法通常具有F0值在6至7。

例如，假設(shè)對(duì)某產(chǎn)品污染菌的情況進(jìn)行了調(diào)查，細(xì)菌的初始數(shù)量（估計(jì)值）為10²cfu，通過(guò)篩選獲得的最強(qiáng)耐熱菌的D值為0.2分鐘。那么，可以在實(shí)際滅菌工作中選擇更高D值的生物指示劑（D121=0.5），要達(dá)到10^-6的殺滅目標(biāo)則需要減少4 個(gè)lg值，則微生物F0值為F0?BIO?= 4×D121?= 4×0.5 = 2.0。即該產(chǎn)品采用F0值=2的滅菌工藝即可達(dá)到實(shí)際微生物殘存概率法<10^-6的效果。

此外，生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法，有必要進(jìn)行每日微生物監(jiān)控，并不斷確認(rèn)微生物負(fù)載的量和耐熱菌的耐熱性。

D：絕對(duì)微生物負(fù)載法

比起上述生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法，絕對(duì)微生物負(fù)載法適合于對(duì)熱更加不穩(wěn)定的品種。思路與前者類似，但不再使用D值更高的生物指示劑，而是直接使用產(chǎn)品中的最強(qiáng)耐熱菌的D值來(lái)確定滅菌工藝的目標(biāo)F0值

假設(shè)下圖是某產(chǎn)品D值與溫度之間的關(guān)系。

圖 某產(chǎn)品D值與溫度之間的關(guān)系圖

從上圖可以看出，耐熱細(xì)菌的D121值為D121?= 10^{-0.1×121+11.5}= 0.25（分鐘），耐熱細(xì)菌為從10⁶減小到10^-6所需的F0值可以通過(guò)以下公式計(jì)算：

F0 = D121?×（lgA－lgB）

將A =10⁶，B =10^-6，D121?= 0.25代入該式，得出F0 = 0.25×（6 + 6）= 3.0。

此處獲得的F0 =3.0是設(shè)定滅菌條件的目標(biāo)值，可依此選擇滅菌條件并進(jìn)行相應(yīng)滅菌驗(yàn)證。實(shí)際上，在受控的生產(chǎn)設(shè)施中觀察到的微生物負(fù)載實(shí)際上遠(yuǎn)少于10⁶cfu，例如，如果最大微生物負(fù)載被證明為10²cfu，則微生物殺滅數(shù)從10²減少到10^-6個(gè)。要求的最小F0值為0.25×（2 + 6）= 2.0，要求F0≥2.0即可確保無(wú)菌。

當(dāng)然，在實(shí)際操作中，尚需考慮增加設(shè)定檢測(cè)回收率等的安全系數(shù)，目標(biāo)F0值不宜太低。

絕對(duì)微生物負(fù)載法，更加有必要進(jìn)行連續(xù)并且頻繁的微生物調(diào)查，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了更強(qiáng)的耐熱菌，則需要評(píng)估對(duì)產(chǎn)品的影響。?

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總結(jié)：

綜上，日本無(wú)菌指南最大的特點(diǎn)是對(duì)F0值<8的熱處理工藝的選擇進(jìn)行了詳細(xì)的講解。這可能是日本的注射劑產(chǎn)品很多都采用這種終端熱處理的原因所在。其實(shí)歐盟2019版的無(wú)菌指南對(duì)熱處理的很多要求和日本是一致的。如其指出：“在滅菌工藝驗(yàn)證中的 SAL取決于用于工藝驗(yàn)證的生物指示劑的耐熱性。當(dāng)在滅菌工藝的驗(yàn)證中使用低D值的生物指示劑時(shí)，SAL在數(shù)值上更高，但是不提供與使用更耐熱的生物指示劑一樣高的安全閾值。SAL 應(yīng)該始終與 D 值相關(guān)，D 值高于常規(guī)生產(chǎn)中的正常生物負(fù)載?！?/em>這里闡述的理念正如日本的生物指示劑和微生物負(fù)載結(jié)合法所表達(dá)的一樣。滅菌條件可以降低，但必須基于科學(xué)的態(tài)度選擇無(wú)菌保證水平最高的方式，并進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證和生產(chǎn)監(jiān)控。?